回答：一抗的孵育時間與温度、抗體濃度有關。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時左右。在室温的條件下，孵育3小時左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時左右。如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長，會導致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現非特性顯色。
一、一抗孵育時間，不能超過多久
1、一抗的定義
一抗指的是能夠和非抗體性抗原（特異性抗原）特異性結合的蛋白，也就是平常所説的抗體。二抗指的是能和抗體結合的抗體，主要用於檢測抗體的存在，放大一抗的信號。
2、一抗的孵育時間
（1）一抗的孵育時間與温度，抗體濃度有關。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時左右。在室温的條件下，孵育3小時左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時左右。
（2）如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長，會導致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現非特性顯色。
二、雙抗體夾心法檢測未知抗原
1、包被
用0.05M碳酸鹽包被緩衝液（ph9.6）對抗體進行稀釋，直至蛋白質含量為1-10μg/ml為止。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。第二天的時候，去掉孔內溶液，然後用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘。
2、加樣
將0.1ml經過稀釋的待檢樣品放到反應孔中，在37℃的環境條件下孵育1小時，然後進行洗滌。
3、加酶標抗體
在各個反應孔中，加入0.1ml新鮮稀釋的酶標抗體，在37℃的環境條件下，孵育0.5-1小時，然後進行洗滌。
4、加底物液顯色
在各個反應孔中，加入0.1mlTMB底物溶液（應當臨時配製），37℃的環境條件下10-30分鐘。
5、終止反應
在各個反應孔孔中，加入0.05ml的2M硫酸。
6、結果測試
（1）在白色背景下，用肉眼進行觀察即可。反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。
（2）在ELISA檢測儀上，於450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，如果大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
